Quantum pBac™
無病毒、高效率的piggyBac基因整合系統，具備高達100 kb的大型載荷能力
在細胞與基因治療中，通常需要實現轉基因的穩定且長期表達。此類持續性的基因表達，可透過使用病毒或非病毒載體系統，於細胞的染色體DNA進行ex vivo或in vivo基因工程改造來達成。基於此目的，無病毒DNA轉座子系統已逐漸成為極具潛力的基因傳遞載體，其中包括 先驅生醫的 Quantum pBac™ 轉座子基因工程系統（圖 2）。
圖1. 我們的 Quantum pBac™ 系統是一種以轉座子為基礎的基因整合系統，由DNA微環供體載體與編碼 Quantum pBase 轉座酶的質體所組成 Quantum pBase 轉座酶的表達可介導目的基因(GOI) 從供體載體中進行「剪切與貼上」，並將其整合至染色體DNA中。
克服現有病毒載體的限制
病毒載體 (如慢病毒與反轉錄病毒) 因具有高效率的基因傳遞能力，廣泛應用於細胞與基因治療中，以介導轉基因整合至染色體。然而，病毒載體具有多項先天性限制，包括：(1 )載荷容量有限；(2) 病毒載體具有免疫原性； (3)傾向整合於活性基因座附近或基因內部，可能產生基因毒性； (4) 病毒介導的基因插入可能導致基因沉默；以及 (5) GMP製造成本高。
基於多項因素，非病毒載體可能較病毒載體更具優勢。例如，無病毒載體能夠傳遞的DNA片段容量可能遠大於傳統病毒載體。此外，由於具有較低的免疫原性與基因毒性潛在風險，無病毒載體也可能具有更高的安全性。最後，無病毒載體的製造成本通常遠低於病毒載體。
圖2. 目前細胞與基因治療中最常見的轉座子基因傳遞系統，通常是透過兩種DNA的共轉染來實現。供體DNA含有一段目的基因 (GOI)，其兩側由末端反向重複序列 (TIRs) 所夾住；另一種DNA則為可表達轉座酶蛋白的質體。轉座酶會將GOI從供體載體中切離，並將其轉移至染色體DNA中。對於 Quantum pBac™等以piggyBac為基礎的系統，GOI會整合至染色體 DNA中的TTAA位點。此種雙DNA傳遞策略能夠在維持高傳遞效率的同時，實現大型DNA載荷的遞送。
作為無病毒基因治療領域的先驅，我們的團隊率先證實，源自甘藍夜蛾 (cabbage moth) 的piggyBac是最具潛力的DNA轉座子系統之一，可應用於基因治療 (Wu S et al.)。延續此研究方向， 先驅生醫 善用piggyBac系統所具備的獨特優勢與理想特性，進一步開發出適用於細胞與基因治療的高效非病毒基因傳遞系統。這些研究成果促成了具備潛在更高安全性與更佳穩健性的 Quantum pBac™ 系統。在CAR T細胞及其他細胞與基因治療的開發與製備方面具有高度潛力(Meir et al.; Meir et al.; Hua et al.).
使用 Quantum pBac™ 系統的優勢特性: (1) 在現有基因治療載體中具備最高的載荷容量 (2) 能夠整合大型基因 (3) 由於不會留下外源性序列殘留，具備可逆式基因工程的潛力 (4) 具有進一步適用於位點特異性基因整合的潛力 (5) 能夠將基因整合至幾乎所有哺乳動物細胞中
在CAR T細胞治療發展中 Quantum pBac™ 的歷史
Quantum pBac™ 源自 piggyBac 轉座子系統，其發展與Sleeping Beauty轉座子系統及CAR T細胞的發展同步進行。
圖 3. 為 Quantum pBac™ 在轉座子介導的基因傳遞系統與CAR T細胞治療發展脈絡中的開發時間軸，Hyperactive piggyBac與Sleeping Beauty 11 (SB11)已被應用於臨床試驗中的CAR T細胞治療開發，就轉座效率而言， Quantum pBac™ 的活性較 Hyperactive piggyBac高出 15 倍 以上，較SB11高出 10,000至40,000倍 以上。目前已獲核准的CAR T細胞療法皆採用慢病毒或反轉錄病毒進行基因傳遞。下一代CAR T細胞療法若應用於自體免疫疾病及實體腫瘤，將需要導入大型多重轉基因，以提升治療的安全性與療效。以轉座子為基礎的基因傳遞系統，能夠將大型基因載荷整合至宿主細胞的DNA中。
我們的 Quantum pBac™ 系統由兩種 DNA 元件組成，分別為Donor載體與Helper質體，使用DNA微環 (minicircle DNA) 作為Donor載體，有助於提升基因傳遞效率、增強基因整合，並確保穩定的基因表達 (圖4)。
圖4. 我們的 Quantum pBac™ 轉座子基因傳遞系統由微環DNA Donor載體與Helper質體組成。經最小化設計、僅含200 bp的Donor載體骨架，可提供較大的載荷容量，能容納編碼不同功能元件的多重轉基因，例如CAR基因、細胞或微環境調節因子，以及安全性控制元件。微環 DNA Donor載體具備較大的載荷容量，能夠攜帶較大型的目的基因 (GOI)。此外，其包含短的末端反向重複序列 (TIRs)，可實現安全且高效的基因工程。因此，Donor載體有助於提升基因傳遞效率，並增強基因表達的穩定性。 Helper質體則編碼 Quantum pBase 轉座酶，負責介導轉基因整合至治療性細胞的基因組中。此高活性且具更高安全性潛力的 Quantum pBac™ 系統，相較於 Hyperactive piggyBac 系統具有多項主要優勢，包括： (1) 更高的載荷容量與基因傳遞效率 (Donor載體尺寸更小) (2) 大幅降低的殘留載體 DNA (0.1 kb；hyPB：0.6 kb) (3) 在人類T細胞中具有極低的增強子及/或沉默子活性 (4) 具有更高安全性的整合特徵潛力 (5) 更高的基因整合效率 (在人類T細胞中提高 >15 倍)。
值得注意的是， Quantum pBac™ 系統相較於Hyperactive piggyBac具有更高的效率與潛在的安全性。在人類Jurkat T細胞中直接比較兩者的基因整合效率後發現， Quantum pBac™ 的基因整合效率明顯更高。
圖5. 與Hyperactive piggyBac相比， Quantum pBac™ 具有更高的基因傳遞效率。Jurkat細胞分別以攜帶潮黴素抗性基因的Hyperactive piggyBac (左圖) 或 Quantum pBac™ (右圖)進行轉染。經潮黴素篩選後，圖中顯示具藥物抗性的細胞。
在初代T細胞中比較轉座效率後發現， Quantum pBase 的轉座效率遠高於Hyperactive piggyBac轉座酶 (見圖 5與圖 6)。透過使用不含質體骨架元件的Donor載體，此高轉座效率可進一步提升。此外，當整合較大型的轉基因時 (4.0 kb vs. 5.4 kb；圖 6)，兩者之間的轉座效率差異也進一步擴大。
圖6. Quantum pBase 轉座酶的效能優於Hyperactive PBase。在初代T細胞中測試所示不同組合的轉座活性。Donor載體分別具有含質體骨架或不含質體骨架的設計；轉座酶則分別由 hyPBase或 Quantum pBase 質體。Donor載體均攜帶相同的基因，用於表達tdTomato與潮黴素抗性基因，兩者由IRES連接。結果以平均值 ± 標準差表示。**p < 0.01。n = 3 (三重複)。
除了具備業界領先的基因整合效率之外， Quantum pBac™ 亦能優先產生具有理想治療特性的細胞。 由於預期以piggyBac為基礎的系統會優先促進 TSCM 細胞的轉座 (T細胞中被認為具有較高安全性及較佳治療效果的細胞亞群)，因此 Quantum pBase 與Hyperactive PBase均可產生較高比例的TSCM 細胞；然而， Quantum pBac™ 可產生更高比例的TSCM細胞 (圖 7)。
