qCART™
克服CAR-T細胞治療的挑戰
嵌合抗原受體T細胞 (CAR-T細胞) 療法已改變部分血液惡性腫瘤的臨床治療方式。然而，目前仍存在多項重大障礙，限制CAR-T細胞療法進一步應用於更前線的治療線別以及拓展至更多適應症。這些障礙包括: (1) 不良事件 ，例如靶點上/腫瘤外毒性及細胞激素釋放症候群 (Cytokine Release Syndrome, CRS)； (2) 治療效力不足 ，尤其是在實體腫瘤中的療效有限；(3) 疾病復發 ，可能源於實體腫瘤中的抗原逃脫/抗原異質性，或CAR-T細胞維持存在性不足；以及 (4) 高昂成本 於製備CAR-T細胞。
臨床經驗顯示，CAR-T細胞的特性是決定其臨床活性的關鍵因素。其中，CAR-T細胞族群中具有較高比例的TSCM 細胞，與較佳的臨床治療結果相關。這種正向作用可能部分源於TSCM 細胞具有幹細胞樣特性，包括高度的自我更新能力及較長的存續時間，進而有助於CAR-T細胞在體內長期持續存在。此外，TSCM 細胞具有較佳的代謝適應能力，且相對較少表現細胞衰老與細胞耗竭之特徵，因此其治療效力可能進一步提升。最後，TSCM 細胞在遇到目標抗原後，並不會立即展現強烈的細胞毒殺活性，而是會進一步擴增並分化為具有高度細胞毒殺能力的TEM 以及TEFF 細胞。因此，相較於處於較晚分化階段的細胞，其細胞所介導的目標細胞毒殺作用及細胞激素釋放，其動力學可能較為緩慢且持續時間更長。綜合而言，上述特性使TSCM 細胞成為CAR-T細胞族群中極具治療價值的細胞亞群。
圖1. T細胞在接觸抗原後會進行分化。抗原活化初始T細胞 (TN )後，會產生具有較長存續時間的TSCM 以及TCM 細胞。這些細胞持續表達 CD62L，並開始表達 CD95。具有自我更新能力的TSCM 以及TCM 細胞，進一步產生可增殖、但存續時間較短的 TEM 以及TEFF 細胞族群。CAR TSCM 細胞被認為是療效最佳且安全性最高的CAR-T細胞族群。
要將CAR-T細胞應用於實體腫瘤，仍需克服多項障礙，包括： (1) CAR-T細胞缺乏向腫瘤組織遷移的能力； (2) 實體腫瘤的抗原異質性；以及 (3) 具有免疫抑制性的腫瘤微環境 (Tumor Microenvironment, TME)，可能對T細胞的功能適應性 (例如促進T細胞分化、耗竭、衰老甚至降低存活率) 產生不利影響。 因此，需要透過技術突破與創新來克服上述挑戰。
病毒載體因具有高效率的基因傳遞與基因整合能力，已廣泛應用於CAR-T細胞療法的製備。然而，使用病毒載體產製的CAR-T細胞仍存在多項限制，包括： (1) 與病毒相關的安全性疑慮； (2) 載荷容量有限； (3) 轉染後細胞擴增能力低和CAR⁺ T細胞比例偏低； (4) CAR-T細胞的體內持續存在性不足；以及 (5) 製造成本高昂。
非病毒系統可克服上述大部分，甚至幾乎所有的障礙。然而，無病毒系統通常需要使用電穿孔，而電穿孔會對細胞的存活率與擴增能力產生負面影響。因此，電穿孔是非病毒CAR-T細胞製備過程中的一項關鍵但可克服的技術挑戰。更重要的是，一個有效的無病毒系統必須能夠將大型多重轉基因整合至T細胞中，同時CAR-T細胞必須具備足夠的擴增能力，以支持臨床規模的藥品製造。
先驅生醫 開發了 Quantum CART (qCART™)平台，一種非病毒的 Quantum Engine™ ，用於開發CAR-T細胞療法，整合四大核心技術，形成完整的解決方案：
(1) GTailor™：一套快速的多重基因設計、構築與篩選系統，能設計出以下特性的CAR-T細胞：(i)可同時辨識多種腫瘤抗原；(ii)攜帶促進CAR-T細胞追蹤至腫瘤和對抗腫瘤微環境的調節因子；以及(iii)內建安全開關，在需要時終止療程。
(2) Quantum Nufect™：高效率的基因遞送緩衝系統，可將目的基因遞送至T細胞，具備(i)可靠穩定的CAR-T細胞生產力，同時(ii)維持高度細胞存活率，並優先將基因傳遞至TSCM 的細胞族群。
(3) Quantum pBac™：非病毒載體系統，具備(i)整合大容量基因能力，和(ii)優先將基因整合至TSCM 細胞之基因體中。
(4) iCellar™：高效細胞擴增系統，可產出臨床規模的CAR-T細胞，具備(i)高比例的CAR⁺ TSCM 細胞，和(ii)優越的細胞適性及表現能力。
綜合上述四大平台， qCART™ 可以實現快速(約10天)、具成本效益以及臨床規模下製備CAR-T細胞(每升約1至3.5x109個細胞) 。更重要的是， qCART™ 能生產具有高度理想特性的CAR-T細胞，其中包含高比例的CAR⁺ TSCM 細胞。 qCART™ 用於製備 GF-CART01 的數據，進一步展現了此系統的優勢。
Table 1. 表 1. 使用灌流式或補料式之培養容器進行CAR-T細胞製備的比較。CAR-T細胞分別於傳統培養盤 (灌流式培養) 或G-Rex (補料式培養)中進行培養。表中呈現CAR⁺ T細胞比例、細胞擴增倍數，以及CD4⁺與CD8⁺ CAR⁺ T細胞亞群的分布。N = 6 位健康捐贈者。
圖2. 圖 2. 使用G-Rex擴增的CAR-T細胞具有高細胞毒殺活性。針對分別於傳統培養盤 (灌流式培養) 或G-Rex (補料式培養) 中培養的CAR-T細胞進行體外功能性分析。將冷凍解凍後的CAR-T細胞以Celigo影像細胞分析系統評估其細胞溶解活性 (cytolytic activity)。CAR-T細胞與Raji-GFP/Luc目標細胞以效應細胞：目標細胞 (E:T) 比例5:1進行共培養48或72小時後，評估CAR-T細胞的細胞毒殺活性。數據來自 6 位健康捐贈者。水平線表示CAR-T細胞對目標細胞造成的平均裂解率。**p < 0.01；***p < 0.001。
表2. 可針對不同靶點並使用不同大小的轉基因製備CAR-T細胞。CAR-T細胞可利用不同大小的轉基因進行製備。將Donor T 細胞以攜帶不同大小轉基因的 Quantum pBac™ 進行核轉染，轉基因大小範圍為3.5 kb至7.6 kb。表中呈現CAR⁺ T細胞比例、細胞擴增倍數，以及CD4⁺與CD8⁺ CAR⁺ T細胞亞群的分布。
